摘要：果树病毒病害一直是制约果树生产持续发展的重要因素。采用无毒种苗是防控果树病毒病害的有效途径之一。脱毒技术是生产无毒苗的核心技术。茎尖超低温脱毒是近年来建立的一种新的脱毒技术。到目前为止，该技术已成功地用于脱除包括李 (Prunus)、香蕉 (Musa)、葡萄 (Vitis vinifera)、草莓 (Fragaria glandiglora)和树莓 (Rubus idaeus) 等果树的6种病毒和柑桔黄龙病 （HLB，一种细菌性病害）。与传统的脱毒方法相比较，茎尖超低温脱毒具有脱毒率高、脱毒率不受茎尖大小及超低温处理方法的影响、脱毒苗生产周期短等优点。更重要的是，茎尖超低温处理可同时实现脱毒与植物种质资源长期保存的双重目标。与传统的脱毒方法一样，基因型特异性强是限制该技术广泛应用的关键因素。本文全面介绍了果树茎尖超低温脱毒研究的发展与现状，并讨论了茎尖超低温脱毒的机理，旨在进一步推动果树茎尖超低温脱毒的研究和应用。
论文关键词：超低温脱毒,超低温保存,果树,茎尖,无毒
　　果树病毒病害一直是制约果树生产持续发展的重要因素。果树被病毒感染后，常表现出营养生长减弱,生长势降低，生理代谢减弱，产量和品质明显下降。严重时,造成果树毁灭性危害。比较带毒苗和无毒苗对营养生长的影响研究表明：苹果茎沟病毒(ASGV)对早酥梨(Pyruspyrifolia)幼树生长有明显的影响，带毒苗的株高、干径和分枝数较无毒苗分别降低13%，11%和51%，而秋季落叶率增长11.4%。王际轩等研究了苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)，苹果茎沟槽病毒(ASGV)和苹果茎痘病毒(ASPV)对苹果产量的影响，结果表明，金矮生、富士和甜黄魁带毒苗的产量分别比对照下降35.4%、31.1%和29.4%。李痘包病毒(PPV)可导致产量降低高达52.94%。最新的研究表明，葡萄扇叶病毒(GFLV)导致“Callet”葡萄产量下降20%以上，而葡萄卷叶病毒(GLRaV-1)可导致“MantoNegro”葡萄减产高达40%以上。带毒苗对果实的维生素C、总糖、总酸及果皮中花青苷也有明显影响。上世纪40年代巴西圣保罗爆发的柑桔衰退病(Citrustristezavirus,CTV)对该地区的柑桔业造成了毁灭性危害。
　　在果树生产上，采用无毒种苗是防控果树病毒病害的有效途径之一。栽培无毒苗能明显促进果树营养生长与幼苗早结果，提高产量与品质。脱毒技术是生产无毒苗的核心技术。因此，建立高效、简易的脱毒技术无疑具有重要的研究价值和实践应用意义。
　　果树传统的脱毒技术包括茎尖培养、热处理、热处理结合茎尖培养和微型嫁接等。茎尖培养对茎尖大小要求十分严格，茎尖过大难以脱毒；而茎尖过小则难以再生完整植株。热处理脱毒费工、费时，并且对耐热性较强的病毒和耐热性较差的植物的应用受到限制。微型嫁接程序复杂，生产周期长。
　　超低温保存(Cryopreservation)是将植物的离体材料如茎尖、细胞等置于液氮中(-196℃)保存的一种技术。在液氮条件下，细胞的分裂活动和生理代谢停止。因此，植物离体材料可以无限期保存，并且保持其遗传稳定性。因此，超低温保存被视为植物种质资源长期保存最理想、最有效的方法。自1960年日本的Sakai博士首次报道植物离体材料超低温成功保存以来，该方法已在包括大田作物和园艺植物、草木和木本植物、温带和热带植物上都有成功的报道。茎尖超低温疗法(Cryotherapyofshoottips)是将茎尖置于液氮中进行短暂处理，脱除病毒的方法。到目前为止，该技术已成功地用于脱除包括李(Prunus)、香蕉(Musa)、葡萄(Vitisvinifera)、草莓(Fragariaglandiglora)和树莓(Rubusidaeus)等果树的6种病毒及柑桔黄龙病(HLB,一种细菌性病害)。茎尖超低温脱毒被认为是脱除植物病毒最有效的方法,为脱毒苗生产开辟了一条崭新的途径。更重要的是，茎尖超低温处理可以同时实现植物种质资源的长期保存与脱除植物病毒双重目标。
　　本文全面地介绍了果树茎尖超低温脱毒的所有案例，讨论了茎尖超低温脱毒的机理，与传统脱毒方法进行了比较。旨在进一步推动果树茎尖超低温脱毒的研究与应用。
　　1果树茎尖超低温脱毒案例介绍
　　1.1李痘包病毒(Plumpoxvirus,PPV)
　　李痘包病毒(PlumpoxPotyvirus,PPV)，是引起李属(Prunus)植物最严重病害Sharka病的病原。PPV可同时感染桃(Prunuspersicae),李(P.domestica),扁桃(P.armeniaca),油桃(P.persicavar.nectarina),杏(P.amygdalus),甜樱桃(P.avium)和酸樱桃(P.cerasus)。李痘包病毒于1932年首次在保加利亚报道。此后，一直是地中海地区果树病毒病害研究的重点。
　　Brison等以感染PPV的李属种间杂交砧木Fereley-Jaspi(R)试管苗为试材，茎尖经玻璃化法超低温处理后，获得再生植株。再生植株经ELISA和IC-PCR检测，其脱毒率为50%。而对照(茎尖培养)的脱毒率仅为19%。根据上述实验结果，Brison等认为，茎尖超低温脱毒有望成为植物脱毒的一种新的有效方法。
　　1.2黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)和香蕉条纹病毒(Bananastreakvirus,BSV)
　　黄瓜花叶病毒(CMV)和香蕉条纹病毒(BSV)分别归属于Geminivirus属和Badnavirus属病毒，前者通过蚜虫传播,而后者通过粉蚧传播。对香蕉生产造成严重危害，也制约香蕉育种。
　　Helliot等用双重感染黄瓜花叶病毒(CMV)和香蕉条纹病毒(BSV)的“Williams”香蕉品种为试材。供试材料在试管中诱导形成群生分生组织(Meristemclumps)。群生分生组织经玻璃化法超低温处理后,培育成完整植株。

植株带毒状况检测(ELISA)表明，分生组织培养对黄瓜花叶病毒的脱毒率为76%，但完全不能脱除香蕉条纹病毒。而超低温处理对黄瓜花叶病毒和香蕉条纹病毒的脱毒率分别为30%和90%。
　　1.3葡萄A病毒(GrapevinevirusA,GVA)
　　葡萄A病毒(GVA)归属于Vitivirus，是葡萄克勃茎沟病(Koberstemgrooving,KSG)的病原。葡萄克勃茎沟病(KSG)是葡萄粗皮综合症(Rugosewoodcomplex)的四种症状类型之一。葡萄A病毒存在于植株韧皮部，由粉蚧传播。感染葡萄粗皮综合症的植株表现出生长势减弱，植株矮小，春季萌芽延迟，严重时会导致植株衰退死亡；部分植株嫁接口上部肿大，形成“小脚”现象；有的嫁接口上部树皮增厚，木栓化，组织疏松粗糙；嫁接口附近的木质部和树皮形成层常可见凹陷的茎痘斑或茎沟槽。染病植株萌芽延迟，生长受到抑制，产量降低，嫁接成活率低。
　　Wang等以田间感染GVA的“Bruti”葡萄品种(VitisviniferaL.)试管苗为试材，取1mm的茎尖进行超低温冷冻。再生植株经WesternBlotting检测其带毒状况。结果表明，茎尖超低温处理的脱毒率为97%,而茎尖培养(0.2mm)为12%。进一步的研究表明，液氮处理前的各步骤均不能脱毒，唯有液氮处理才能脱毒。这一结果证明，超低温脱毒是通过液氮处理而实现的。对超低温处理获得的再生植株的形态观察结果表明，其植株的叶片形态与对照是一致的。基于上述结果，作者认为茎尖超低温脱毒是一种简便而有效的脱毒技术，为植物脱毒开辟了一条崭新的途径。
　　1.4草莓轻型黄边病毒（Strawberrymildyellowedgevirus,SMYEV）
　　草莓轻型黄边病毒(SMYEV)是危害我国草莓生产的4种主要病毒之一，主要危害草莓属植物。SMYEV属黄症病毒属，通过蚜虫传播。单独侵染时，仅使植株轻矮化，但该病毒很少单独发生，常与其他病毒复合侵染，引起叶片黄化或叶缘失绿，植株生长势严重减弱，植株矮化，产量和果实质量严重下降，减产可高达75％。
　　蔡斌华等以草莓品种“明宝”为材料，取茎尖做初代培养。继代扩繁5次后，取2mm左右的茎尖，利用玻璃化超低温处理茎尖，获得再生植株。用RT-PCR技术对再生植株进行病毒检测。结果表明，经玻璃化超低温处理后，对SMYEV的脱除率为95％，而对照完全不能脱毒。
　　1.5树莓丛生矮化病毒(Raspberrybushydwarfvirus,RBDV)
　　树莓丛生矮化病毒(RBDV)是Idaeovirus属的唯一一种,该病毒通过花粉传播，可危害树莓(Rubusidaeus)、罗甘莓(R.loganobaccus)、博伊森莓(R.ursinus)和黑树莓(R.occidentalis)等。在全球悬钩子属果树主产区均有分布。给悬钩子属果树生产造成巨大危害。已有的研究结果表明，树莓丛生矮化病毒难以通过传统的脱毒技术(如茎尖培养、热处理、热处理结合茎尖培养等)脱除。
　　Wang等以感染RBDV的树莓试管苗为试材，分别进行了茎尖培养(0.1-0.3mm)、热处理结合茎尖培养(1mm)及茎尖(1mm)超低温疗法。结果表明，上述三种方法均不能脱毒。随后，Wang等把热处理和茎尖超低温相结合以期脱除RBDV。他们先将带毒的试管苗置于热处理条件下(白昼38℃，黑夜26℃，16小时的光周期)处理4-5周后，取茎尖(1mm)进行超低温处理。结果发现，热处理4-5周的茎尖经超低温处理后，其脱毒率可达33-35%。由此，他们认为，热处理结合茎尖超低温处理可能是目前植物脱毒最有效的一种方法，该法甚至能有效地脱除能侵染茎尖分生组织的病毒，如RBDV。
　　1.6柑桔黄龙病(CitrusHuanglongbing,HLB)
　　柑桔黄龙病(CitrusHuanglongbing,HLB)又称黄梢病、黄枯病、青果病，是由一种被称为韧皮部杆菌的细菌引起的病害。该细菌寄生在柑桔韧皮部筛管细胞内，为革兰氏阴性细菌(CandidatusLiberobacterasiaticum)。该病原通过柑桔木虱传播。HLB能侵染柑桔属(Citrus)、金柑属(Fortunella)和枳属(Poncirus)植物。主要分布在亚洲和非洲的40多个国家。在我国，主要分布在广东、广西、福建和台湾四省。感病后的柑桔树可在3-5年内丧失结果能力，甚至导致植株死亡。给柑桔生产造成巨大经济损失。
　　Ding等对茎尖超低温脱除HLB进行了系统研究。他们发现，利用茎尖超低温处理能有效地脱除HLB。对5个材料的HLB脱除率分别为：罗岗橙，93%、碰柑，93%、沙田柚，94%、北京柠檬，91%和红江橙，91%。
　　2茎尖超低温脱毒的机理
　　病毒在植物体内的分布是不均匀的：带毒植株的病毒浓度随距顶端分生组织靠近而降低；反之，则升高。

因此，顶端分生组织可能形成一个无毒区。茎尖培养正是利用这一概念来获得无毒苗。
　　为了揭示茎尖经超低温脱毒的机理，对超低温处理后成活细胞在茎尖的分布和超低温处理前病毒在茎尖的分布做了大量研究。结果表明，茎尖经超低温处理后，绝大部分细胞被冻死，仅有分生组织顶端几层细胞和第一、第二叶原基的部分细胞能成活。这些成活的细胞，在超低温处理前，细胞胞核大、核仁明显，胞质中的液泡小，高尔基体、线粒体、内质网和原质体明显。胞核与胞质比大。对甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮缩病毒(SPCSV)在茎尖分生组织中的定位研究表明,不管是单一感染还是混合感染，SPFMV仅能侵染第四叶原基及其以外的组织；而SPCSV则只能侵染第五叶原基及其以外的组织。上述结果表明，带毒的茎尖经超低温处理后，带毒的细胞基本不能成活，而成活的细胞大多是不带毒的，由此而发育的完整植株则可能是无毒的。
　　值得注意的是，上述解释仅适合于不能侵染茎尖分生组织的病毒种类，如洋李痘包病毒、香蕉条纹病毒和葡萄A病毒等；而对那些能侵染茎尖分生组织的病毒(如RBDV)是不适合的。对这类病毒而言，单一的茎尖超低温处理难以脱毒，热处理结合茎尖超低温处理才可能脱毒。
　　3超低温脱毒与传统脱毒技术的比较
　　3.1脱毒率高
　　大量的研究表明，茎尖超低温处理的脱毒率远远高于传统的茎尖培养。以GVA为例，茎尖超低温处理的脱毒率为97%，而茎尖培养仅能获得12%的脱毒率。
　　3.2茎尖超低温脱毒率不受茎尖大小的影响
　　茎尖大小是影响茎尖培养脱毒率的关键因素。茎尖培养时，多用0.2-0.4mm茎尖,取材难。与之比较，茎尖超低温脱毒率不受茎尖大小的影响。以SPFMV和SPCSV为例，用超低温处理0.5-1.5mm的茎尖均能获得100%的脱毒率；而茎尖培养时，0.5-1.0mm的茎尖能完全脱毒，当茎尖增大到1.5mm时，对SPFMV的脱毒率仅为7%。
　　3.3茎尖超低温脱毒率不受超低温方法的影响
　　大量的实验结果表明：一种超低温处理方法可能仅适合于某一(或某些)基因型，而不能适合另一(或另一些)基因型。到目前为此，针对某一(或某些)基因型已建立了多种茎尖超低温保存方法。不同基因型多种超低温保存方法的建立，为不同基因型的超低温脱毒提供了技术条件。已有的研究表明，不同茎尖超低温处理方法对脱毒率没有影响。
　　3.4茎尖超低温脱毒的周期与茎尖培养相似
　　脱毒苗生产周期的长短会直接影响无毒苗的生产成本。已有的研究表明，茎尖超低温脱毒所需时间与茎尖培养相似，而明显短于热处理及热处理结合茎尖培养。
　　3.5茎尖超低温脱毒表现出基因型特异性
　　大量实验结果表明，超低温处理表现出基因型特异性，主要影响超低温处理茎尖的成活率与再生率。这是限制超低温脱毒广泛应用的关键因素。然而，传统的脱毒技术，如茎尖培养，同样存在基因型特异性。
　　3.6茎尖超低温处理可同时实现脱毒与种质资源长期保存的双重目标
　　将茎尖置于液氮中长期处理，可实现资源的长期保存；而将茎尖置于液氮中行短暂处理，可实现脱毒，获得无毒苗。因此，茎尖超低温处理可同时实现脱毒与种质资源长期保存的双重目标]。
　　4结论与展望
　　到目前为此，茎尖超低温疗法已成功地用于脱除包括李(Prunus)、香蕉(Musa)、葡萄(Vitisvinifera)、草莓(Fragariaglandiglora)和树莓(Rubusidaeus)等果树的6种病毒和柑桔黄龙病。与传统脱毒技术相比，茎尖超低温脱毒具有多种优点，已被确认为一种新的脱毒技术。目前，尚缺乏对超低温脱毒苗的遗传稳定性鉴定与田间表现观察的研究，同时，研究的种类较少。应加强该技术在其它果树植物上的研究，并逐步在生产中应用。